O acervo do Museu do Café começou a se formar alguns anos após a sua inauguração, entre 2004 e 2005. O objetivo inicial dos processos de aquisição era captar acervos para a montagem da primeira exposição de longa duração do Museu: A trajetória do café no Brasil. Uma grande ação de captação de acervos foi realizada, em 2005, pela equipe técnica ao visitar o Posto de Armazenagem de Carapicuíba, onde estavam objetos pertencentes ao antigo Instituto Brasileiro de Café (IBC). Grande parte dos objetos incorporados ao acervo é proveniente de antigos escritórios de corretagem, armazéns gerais ou firmas de classificação e exportação de café da cidade de Santos.
Esse acervo inicial está ligado diretamente ao comércio e à exportação de café. No entanto, havia ainda a necessidade de incorporar acervos referentes ao percurso completo do café: do cultivo e preparação das sementes, instalação do cafezal, colheita, beneficiamento, transporte, armazenagem às etapas de comercialização e consumo final.
Para preencher essas lacunas, recorreu-se mais tarde à aquisição, por meio de compra ou doação, de objetos que compunham o cenário do trabalho nas fazendas produtoras de café e de xícaras e embalagens das principais marcas de café nacionais e internacionais.
Outro destaque é o acervo integrado ao edifício, caracterizado por elementos de sua arquitetura como as esculturas da fachada e da torre, ou elementos de seu interior, como o mobiliário do Salão do Pregão, as telas e o vitral de Benedicto Calixto, os relógios, entre outros.
